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细胞培养的一些问题
点击次数:432 发布时间:2017-07-12
细胞培养常见问题

1. 液体培养基的保存是冷藏好?还是冷冻好?

要冷藏!!因为液体培养基经冷冻后再经溶化时,其溶液的pH值会发生改变,溶液往往变碱,某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中,通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月 ~ 一年。



2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用,及使用方法。

几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。所以,各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置-20 ?C冰冻保存,用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ?C 冰箱储存两周以上时,应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度(100倍)的谷氨酰胺溶液(1ml/支)。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中,其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色,-24?C保存。



3.培养用液pH对细胞生长的影响

由于,大多数细胞适宜pH为7.2~7.4,偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同,原代培养细胞一般对pH变动耐受差,无限细胞系耐受力强。

但总体来说,细胞耐酸性比耐碱性强一些,偏酸环境中更利于细胞生长。因此,我们在配制培养用液时,可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时,溶液的pH还会向上浮动0.2左右。



4.常用培养基及培养用液的渗透压范围

培养基名称 渗透压范围(mOSM)

DMEM(高糖) 315 ~ 350

DMEM(低糖) 270 ~ 330

RPMI-1640 260 ~ 290

MEM-EBSS 280 ~ 310

MEM-NEAA 280 ~ 310

McCoy 280 ~ 310

MEM-a 280 ~ 310

M—199 275 ~ 305

IMDM 270 ~ 300

DMEM/F-12 280 ~ 310

F—10 270 ~ 300

F—12 275 ~ 300

培养基名称 渗透压范围(mOSM)

L—15 280 ~ 320

D-Hanks 280 ~ 300

Hanks 280 ~ 300

PBS 275 ~ 300

5.细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗?

不见得!因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下,pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用能力zui强。另外,钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前,一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶,以便于将含血清的培养基冲洗干净,这样就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液浓度为:

(1)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA;

(2)0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA。

(3)0.25% 胰蛋白酶

溶液pH8.0~9.0;使用D-Hank液配制。

多数细胞传代消化可使用0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA这种消化液。



6.培养基在使用过程中应注意的问题:

(1). 培养基在使用前需37 oC预热或在室温平衡后再使用。

(2). 细胞培养过程中,吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼,防止残留在吸管内的培养基焦化,将有害物质带入培养液中。

(3). 尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。

(4). 避免液体间、细胞间的交叉污染。

(5).配制完全培养基时,配制的量zui好在2周内用完为好。



7.血清的有关问题:

新生牛血清:新出生牛5天内取血制成

小牛血清:小牛出生16周以内采血制成。

胎牛血清:(进口血清)要求剖腹取胎制成。

国内厂家往往不能做到,经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。

根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为:

(1).特级胎牛血清:40纳米过滤,内毒素含量≤10EU,

血红蛋白含量≤10mg/dl。

(2).优等胎牛血清:经过3次100纳米过滤,

内毒素含量≤25EU/ml,

血红蛋白含量≤25mg/ml。



(3).标准胎牛血清:3次100纳米过滤,低内毒素,

低血红蛋白含量。

(4).活性碳/葡聚糖处理血清:激素含量大大降低。

(5).透析型胎牛血清:次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。



8. 其他细胞培养用液:除培养基、血清、谷氨酰胺外,其他几种液体也属必须,不可省略。

(1).双抗:200倍,(1ml/支)其终浓度为青霉素100U/ml;链霉素100ug/ml,-24 oC保存。

(2).L-谷氨酰胺:100倍,(1ml/支), 终浓度2mM,-24 oC保存。

(3).丙酮酸钠:配制浓度50mM,4ml/支,终浓度为1mM/ml,

-24 oC保存。

(4).Hepes液:配制浓度1M(5ml/支),一支Hepes加入到200ml

完全培养基中,终浓度为25mM/ml,常温保存。



9.支原体污染及检测:

(1).支原体污染在细胞培养中zui常见、不易被查觉,但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的zui小微生物,它无细胞壁,形态呈高度多形性,zui小直径0.2um,可通过滤器。





目前中心通过对国内100余株/系细胞的检测,形势不容乐观。污染率达30% ~ 60% 。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后,它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长,并能降低细胞的融合率。因此,在运用各种细胞系进行实验研究时,首先要证明所用细胞有无支原体的污染。

(2).支原体污染后,培养基可不发生浑浊,细胞病变轻微或不明显,因此难以发现。目前,支原体检测的方法有以下几种。

(a).相差显微镜观察;(b).低张处理地衣红染色法;

(c).荧光染色法;(d).酶标法;

(e).PCR法:基础医学细胞中心使用该方法进行检测。

优点:灵敏度高,检测耗时短,样品量小

(只需50ul细胞培养用液上清)。
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